Двухфотонный лазерный микроскоп
Двухфотонный лазерный микроскоп
Двухфотонный лазерный микроскоп — это лазерный микроскоп, который позволяет наблюдать живые ткани на глубине более одного миллиметра, применяя явление флуоресценции.Двухфотонный микроскоп представляет собой разновидность мультифотонного флуоресцентного микроскопа.Он имеет следующие преимущества в сравнении с конфокальным микроскопом: низкая степень фототоксичности, большая проникающая способность.
Двухфотонный лазерный микроскоп основан на физическом принципе, описанном Марией Гёпперт-Майер в её докторской диссертации в 1931 году. Процесс двухфотонного возбуждения осуществляется следующим образом: два фотона, которые обладают низкой энергией, возбуждают флюорофор в течение одного квантового события.В результате такого возбуждения происходит последующее испускание возбужденными молекулами флюоресцентного фотона.Энергия флуоресцентного фотона превышает энергию возбуждающих фотонов.Вероятность того, что оба фотона возбуждения будут поглощены одной молекулой, очень мала.
Поэтому необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц). Двухфотонный микроскоп был впервые сконструирован Винфредом Денком в лаборатории В.В.Вебба в Корнелльском университете .Им была скомбинирована идея двухфотонного возбуждения с лазерным сканированием.
В двухфотонном микроскопе луч инфракрасного лазера сфокусирован при помощи собирающей линзы объектива.Обычно используется высокочастотный 80 МГц сапфировый лазер, испускающий импульс с длительностью 100 фемтосекунд, которая обеспечивает высокую плотность фотонного потока, необходимую для двухфотонного поглощения. Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектр возбуждения в промежутке 400—500 нм, в то время как длина волны возбуждающего лазера находится в промежутке 700—1000 нм (область инфракрасных волн).Если флюорофор поглотит одновременно два фотона, то он получит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние.Далее возбужденный флюорофор испустит один фотон (в видимой части спектра), длина волны которого зависит от типа флюорофора.
